綠色添加劑溶菌酶及其應(yīng)用 |
摘 要 溶菌酶廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物中,在雞蛋清中含量較高。具有抗菌消炎、抗病毒、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)雙歧桿菌增殖等作用。溶菌酶能有效地水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖,使細(xì)胞壁變得松弛,細(xì)胞溶解死亡。溶菌酶在酸性條件較穩(wěn)定,可與一些物質(zhì)形成絡(luò)合物導(dǎo)致其活性喪失。溶菌酶在食品防腐、在醫(yī)學(xué)、畜牧和生物工程等領(lǐng)域?qū)⒂袕V泛的應(yīng)用。 關(guān)鍵詞 溶菌酶;作用;機(jī)理;影響因素;應(yīng)用 溶菌酶(Lysozyme,EC3.2.1.17)又稱細(xì)胞壁質(zhì)酶(Murami dase)或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶(N-Acetyl muramide Glycanohydralase)。1922年英國(guó)細(xì)菌學(xué)家A. Fleming發(fā)現(xiàn)人的唾液、眼淚中存在有溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名為溶菌酶。此后在人和動(dòng)物的多種組織、分泌液及某些植物、微生物中也發(fā)現(xiàn)了溶菌酶的存在。隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)不僅有溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的溶菌酶,還有作用于真菌細(xì)胞壁的種類,同時(shí)對(duì)其作用機(jī)制也有了更進(jìn)一步的了解。近幾年,人們根據(jù)溶菌酶的溶菌特性,將其應(yīng)用于醫(yī)療、食品防腐、畜牧及生物工程中,具有一定的應(yīng)用價(jià)值。 1 溶菌酶的種類 溶菌酶按其所作用的微生物不同分兩大類,即細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶和真菌細(xì)胞壁溶菌酶。細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶有兩種,一種是作用于β-1,4糖苷鍵的細(xì)胞壁溶解酶,另一種是作用于肽“尾”和酰胺部分的細(xì)胞壁溶解酶。真菌細(xì)胞壁溶菌酶包括酵母菌細(xì)胞壁溶解酶和霉菌細(xì)胞壁溶解酶。 溶菌酶廣泛地分布于自然界中,在人的組織及分泌物中可以找到,動(dòng)物組織中也有,以雞蛋清中含量最多。其它植物組織及微生物細(xì)胞中也存在。根據(jù)來源不同,其性質(zhì)及作用機(jī)制略有差異。 1.1 雞蛋清溶菌酶 雞蛋清溶菌酶占蛋清總蛋白的3.4%~3.5%,作為溶菌酶類的典型代表,是目前重點(diǎn)研究的對(duì)象,也是了解最清楚的溶菌酶之一。它由18種129個(gè)氨基酸殘基組成,具有4個(gè)S-S鍵,分子量為14 000,等電點(diǎn)為11.1,最適溫度為50℃,最適pH值為6~7,其化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定,在pH1.2~11.3范圍內(nèi)劇烈變化時(shí),結(jié)構(gòu)仍穩(wěn)定不變。遇熱也很穩(wěn)定,在pH4~7、100℃處理1min不失活,是一種穩(wěn)定的堿性蛋白質(zhì),但在堿性條件下對(duì)熱穩(wěn)定性較差。 其它鳥類如鵪鶉、珍珠雞、火雞等的蛋清中也分離純化出溶菌酶,與雞蛋清溶菌酶活性非常相似,也由129個(gè)氨基酸組成,雖排列順序有所不同,但活性部位的氨基酸排列則大體相同。 1.2 人及哺乳動(dòng)物溶菌酶 人溶菌酶存在于眼淚、唾液、鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺、白血球、肝、腎、淋巴組織中,1ml眼淚中含7mg溶菌酶,1ml乳汁中含0.1~0.5mg。人溶菌酶由130個(gè)氨基酸殘基組成,有4個(gè)S-S鍵,分子量為14 600,其溶菌活性比雞蛋清溶菌酶高3倍。 對(duì)于哺乳動(dòng)物溶菌酶,目前已從牛、豬、貓、兔、猴、馬、羊等動(dòng)物的乳汁中分離出溶菌酶,其化學(xué)性質(zhì)與人溶菌酶相似,但結(jié)構(gòu)尚不清楚,其溶菌活性也遠(yuǎn)低于人溶菌酶約3 000倍。曾林(1999)采用瓊脂平板法測(cè)定家兔初乳溶菌酶含量。結(jié)果表明:初乳溶菌酶含量為(7.96±2.01)μg/ml,常乳溶菌酶含量(5.01±1.32)μg/ml。人及哺乳動(dòng)物溶菌酶的作用機(jī)制與雞蛋清溶菌酶相同。 1.3 植物溶菌酶 目前已從木瓜、無花果、蕪菁、大麥等植物中分離出溶菌酶,其分子量較大,約為24 000~29 100。植物溶菌酶對(duì)溶壁小球菌的溶菌活性不超過雞蛋清溶菌酶的1/3,但對(duì)膠體狀甲殼質(zhì)的分解活性則是雞蛋清溶菌酶的10倍。周澤文(1994)從菜心分離溶菌酶表明,酶比活力達(dá)3 414. 6U/mg,純化倍數(shù)為197.4。菜心溶菌酶在較寬的溫度和pH植范圍內(nèi)均有活性,最適溫度為60℃,最適pH值為5.8。高向陽(yáng)(1997)研究了蘿卜溶菌酶對(duì)白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿3種革蘭氏陽(yáng)性菌和變形菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌、多殺巴斯德氏桿菌、雛白痢沙門氏菌、產(chǎn)氣桿菌6種革蘭氏陰性菌及釀酒酵母、總狀毛霉、黑根霉、黑曲霉、青霉5種真菌的抑菌效果。同時(shí)還研究了蘿卜溶菌酶對(duì)白菜軟腐病菌、柑橘潰瘍病菌、番茄青枯病菌、水稻細(xì)條病菌、水稻白葉枯病菌及煙草青枯病菌6種植物病原細(xì)菌的抑菌效果。試驗(yàn)證明:蘿卜溶菌酶對(duì)上述參試的菌種都有不同程度的抑菌作用。 1.4 微生物產(chǎn)生的溶菌酶 目前微生物產(chǎn)生的溶菌酶分為7類:①內(nèi)N-乙酰已糖胺酶,此酶同于雞蛋清溶菌酶,破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵;②酰胺酶,切斷細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中NAM與肽“尾”之間的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸鍵;③內(nèi)肽酶,使肽“尾”及肽“橋”內(nèi)的肽鍵斷裂;④β-1,3、β-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶,此酶分解酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁;⑤殼多糖酶,與葡聚糖酶共同作用,可分解霉菌和酵母;⑥磷酸甘露糖酶,與葡甘露糖酶共同作用,可分解原生質(zhì);⑦脫乙酰殼多糖酶,主要分解毛霉和根霉。 1.5 噬菌體產(chǎn)生的溶菌酶 該酶是一種特異性的酶,由噬菌體感染、誘導(dǎo)產(chǎn)生,但未被感染的宿主細(xì)胞上不存在該酶。 2 溶菌酶的作用 2.1 抗菌消炎 溶菌酶是一種能水解粘多糖的堿性水解酶,此類粘多糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分之一,該酶能催化水解細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1,4糖苷鍵,使細(xì)胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽,細(xì)菌內(nèi)容物逸出而使細(xì)胞壁溶解。溶菌酶能直接水解革蘭氏陽(yáng)性菌,在分泌型免疫球蛋白A、補(bǔ)體的參與下,還能水解革蘭氏陰性菌如大腸桿菌等。此外,它還可與各種誘發(fā)炎癥的酸性物質(zhì)結(jié)合,使其失活,并能增強(qiáng)抗生素和其它藥物的療效,改善組織基質(zhì)的粘多糖代謝,從而達(dá)到消炎、修復(fù)組織的目的。 梁愛華(2001)考察在不同溫度下雞蛋清溶菌酶與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大腸埃希氏菌的生長(zhǎng)及內(nèi)毒素釋放的影響。結(jié)果:在不同的培養(yǎng)溫度下,氨芐西林或頭孢噻肟50 μg/ml均可導(dǎo)致細(xì)菌溶解,并誘導(dǎo) Escherichia coli釋放大量的內(nèi)毒素到培養(yǎng)上清液中,這些培養(yǎng)上清液在體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞上可誘導(dǎo)大量的腫瘤壞死因子(TNFα)和白細(xì)胞介素6(IL-6)產(chǎn)生。而雞蛋清溶菌酶與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用能阻止細(xì)菌溶解,降低細(xì)菌內(nèi)毒素的釋放,并減少巨噬細(xì)胞TNF-和IL-6的產(chǎn)生。 2.2 抗病毒 溶菌酶能與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接作用,與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽,使病毒失活。該酶也可以預(yù)防和治療病毒性肝炎,尤其對(duì)輸血后肝炎及急性肝炎的效果較為顯著。在機(jī)體內(nèi)它還有抗流感病毒的活性,其與膽酸鹽的復(fù)合物能強(qiáng)烈抑制流感病毒和腺病毒的生長(zhǎng),并能防止皰疹性病毒感染。 2.3 增強(qiáng)免疫力 溶菌酶作為機(jī)體非特異免疫因子之一,參與機(jī)體多種免疫反應(yīng),在機(jī)體正常防御功能和非特異免疫中,具有保持機(jī)體生理平衡的重要作用??筛纳坪驮鰪?qiáng)巨嗜細(xì)胞吞噬和消化功能,激活白細(xì)胞吞噬功能,并能改善細(xì)胞抑制劑所導(dǎo)致的白細(xì)胞減少,從而增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力。 2.4 其它方面的藥理作用 溶菌酶還具有激活血小板的功能,可以改善組織局部血液循環(huán)障礙,分泌膿液,增強(qiáng)局部防衛(wèi)功能,從而體現(xiàn)其止血、消腫等作用。它還可以作為一種宿主抵抗因子,對(duì)組織局部起保護(hù)作用。 2.5 促進(jìn)雙歧乳酸桿菌增殖 溶菌酶在嬰兒體內(nèi)可以直接或間接促進(jìn)嬰兒腸道細(xì)菌雙歧乳酸桿菌的增殖,促進(jìn)嬰兒消化吸收,可以促進(jìn)人工喂養(yǎng)嬰兒腸道細(xì)菌的正?;?;能夠加強(qiáng)血清滅菌蛋白(Properdin),γ-球蛋白(γ-globulin)等體內(nèi)防御因子對(duì)感染的抵抗力,特別對(duì)早產(chǎn)嬰兒有防御體重減輕、預(yù)防消化器官疾病、增進(jìn)體重等功效。 3 抗菌機(jī)理 細(xì)菌的細(xì)胞壁由胞壁質(zhì)組成,胞壁質(zhì)是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine)及N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid)交替組成的多聚物,胞壁酸殘基上可以連接多肽,稱為肽聚糖(Peptidoglycan)。肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分,它是由NAM、NAG和肽“尾”(一般是4個(gè)氨基酸)組成,NAM與NAG通過β-1,4糖苷鍵相連,肽“尾”則是通過D-乳酰羧基連在NAM的第3位碳原子上,肽尾之間通過肽“橋”(肽鍵或少數(shù)幾個(gè)氨基酸)連接,NAM、NAG、肽“尾”與肽“橋”共同組成了肽聚糖的多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),作為細(xì)胞壁的骨架,上述結(jié)構(gòu)中的任何化學(xué)鍵斷裂,皆能導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的損傷。溶菌酶能有效地水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖,其水解位點(diǎn)是N-乙酰胞壁酸(NAM)的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子間的β-1,4糖苷鍵,結(jié)果使細(xì)菌細(xì)胞壁變得松弛,失去對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用,最后細(xì)胞溶解死亡。 對(duì)于G+細(xì)菌與G-細(xì)菌,其細(xì)胞壁中肽聚糖含量不同,G+細(xì)菌細(xì)胞壁幾乎全部由肽聚糖組成,而G-細(xì)菌只有內(nèi)壁層為肽聚糖,因此,溶菌酶只能破壞G+細(xì)菌的細(xì)胞壁,而對(duì)G-細(xì)菌作用不大。 |
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